2018-08-31
一直以来，普洱茶致癌的说法屡见报端，也有普洱茶中检出黄曲霉毒素的报道，这让消费者疑虑重重，甚至不敢喝普洱茶。因此，如何能够快速准确的检测出茶叶中黄曲霉毒素的含量，是大家非常关心的。
迪马科技技术实验室在参考各种标准的基础上，建立了《茶叶中5种黄曲霉毒素的检测》方案，具有以下特点：
采用固相萃取-UPLC-MS/MS法，可同时检测5种黄曲霉毒素，并能够达到准确定性定量；
黄曲霉毒素检测专用净化柱ProElut AFT-4柱由多种吸附剂按照一定的比例分层填装而成，采用不同作用机理去除杂质，同时对黄曲霉毒素没有不可逆吸附，保证了样品的净化效果及回收率；
避免了免疫亲和柱容易受环境影响而引起黄曲霉毒素回收率低和净化效果不好的弊端；
商品化的成品柱，吸附剂稳定性好，不受外界环境因素影响，保证实验结果的重现性和准确性；
过柱过程操作步骤简单，节省时间，降低检测成本，提高工作效率。
以下为详细解决方案，敬请参考！
1、适用范围
本方案适用于半发酵、全发酵和重发酵茶叶中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1的检测。本方法定量限是5.0 μg/kg。
2、标准品配制
(1) 储备液单标
|
目标物 |
浓度(μg/mL) |
溶剂 |
|
AFT B1 |
20.0 |
甲苯 |
|
AFT B2 |
100.0 |
甲苯 |
|
AFT G1 |
50.0 |
甲苯 |
|
AFT G2 |
2.0 |
甲醇：苯（2:98） |
|
AFT M1 |
1.25 |
乙腈 |
(2) 中间液混标100 μg/L，乙腈溶剂
(3) 添加水平：5.0 μg/kg，100 μg/L 100 μL
3、样品制备
称取2.0 g 样品，加入20 mL 85%乙腈水，振荡2 min，超声10 min，6000 rpm离心2 min，收集上清液，取出5 mL待净化。
4、净化—— ProElut AFT-4 6 mL (Cat.#：65934)
|
a活 化： |
依次加入5 mL乙腈和5 mL 85%乙腈水，流出液弃去； |
|
b上 样： |
将上样液加入柱中，收集流出液； |
|
c淋 洗： |
用5 mL 85%乙腈水淋洗，收集流出液； |
|
d重新溶解： |
合并上样和淋洗步骤的流出液，在50 ℃下用减压蒸馏将洗脱液浓缩至近干，然后用流动相重新定容至1 mL。 |
同方法制备基质匹配标准溶液
5、色谱条件
UHPLC 条件：
色谱柱：Leapsil C18，100 × 2.1 mm，2.7 μm (Cat#：86005)
流 速：0.3 mL/min 进样量：5 μL 柱 温：40 ℃
流动相： A：0.1%甲酸水 B：乙腈+甲醇（1+1）
梯度设置
|
时间/Min. |
0 |
6 |
7 |
12 |
|
A（%） |
65 |
40 |
65 |
65 |
|
B（%） |
35 |
60 |
35 |
35 |
质谱条件：
|
电离模式：ESI |
扫描方式：正离子扫描 |
|
检测方式：多反应监测 |
电喷雾电压：5500 V |
|
雾化气压力：50 psi |
辅助气压力：50 psi |
|
气帘气压力：20 psi |
离子源温度：500 ℃ |
定性离子对、定量离子对、碰撞气能量及去簇电压见下表
|
药物名称 |
定性离子对（m/z） (母离子/子离子) |
定量离子对（m/z） (母离子/子离子) |
碰撞气能量/eV |
去簇电压/V |
|
AFB1 |
313.0/241.0 |
313.0/241.0 |
51 |
78 |
|
313.0/285.0 |
51 |
|||
|
AFB2 |
315.0/259.0 |
315.0/259.0 |
40 |
77 |
|
315.0/287.0 |
40 |
|||
|
AFG1 |
329.0/200.0 |
329.0/200.0 |
56 |
74 |
|
329.0/243.0 |
56 |
|||
|
AFG2 |
331.0/189.0 |
331.0/189.0 |
60 |
61 |
|
331.0/313.0 |
60 |
|||
|
AFM1 |
329.0/273.0 |
329.0/273.0 |
40 |
64 |
|
329.0/243.0 |
40 |
6、添加回收结果
茶叶中黄曲霉毒素检测（添加水平5 μg/kg）的添加回收结果（%）
|
基质 |
AFT B1 |
AFT B2 |
AFT G1 |
AFT G2 |
AFT M1 |
|
普洱 |
94.0 |
102.4 |
106.6 |
93.2 |
96.2 |
|
小叶红茶 |
96.0 |
99.2 |
87.2 |
108.4 |
87.6 |
|
大红袍 |
94.4 |
93.8 |
86.4 |
95.0 |
92.6 |
5种黄曲霉毒素标准品2.5 μg/L的MRM色谱图
1 AFT M1，2 AFT G2，3 AFT G1，4 AFT B2，5 AFT B1
5种黄曲霉毒素标准品2.5 μg/L的TIC色谱图
黄曲霉毒素M1 2.5 μg/L的XIC色谱图
黄曲霉毒素G2 2.5 μg/L的XIC色谱图
黄曲霉毒素G1 2.5 μg/L的XIC色谱图
黄曲霉毒素B2 2.5 μg/L的XIC色谱图
.png)
黄曲霉毒素B1 2.5 μg/L的XIC色谱图
茶叶中5种黄曲霉毒素的检测相关产品信息：
|
货号 |
名称 |
规格 |
|
样品前处理 |
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|
65934 |
黄曲霉毒素检测专用固相萃取柱 ProElut AFT-4 |
6 mL, 30/pk |
|
82O-COIAC1005 |
黄曲霉毒素M1免疫亲和柱 |
3 mL, 25/pk |
|
82O-COIAC1001 |
黄曲霉毒素总量(B1、B2、G1、G2) 免疫亲和柱 |
1 mL, 25/pk |
|
82O-COIAC1004 |
黄曲霉毒素总量(B1、B2、G1、G2) 免疫亲和柱 |
3 mL, 25/pk |
|
244358 |
12管防交叉污染真空SPE萃取装置 |
12位 |
|
4803 |
1,3,6 mL柱管通用连接器 |
15/pk |
|
4806 |
考克(控制流量) |
15/pk |
|
99011 |
真空/正压两用泵，无油 |
1/pk |
|
99013 |
抽滤瓶套装 (包括硅橡胶管2米,2L抽滤瓶及橡胶塞) |
1/pk |
|
30039 |
FitMax针头式过滤器 Nylon |
13 mm,0.22 μm 100/pk |
|
30040 |
FitMax针头式过滤器 Nylon |
13 mm,0.45 μm 100/pk |
|
标准品 |
||
|
82O-S02017-1ML |
黄曲霉毒素B1(AFB1) [1162-65-8] |
2 μg/mL溶于乙腈, 1 mL |
|
82O-S02018-1ML |
黄曲霉毒素B2(AFB2) [7220-81-7] |
0.5 μg/mL溶于乙腈,1 mL |
|
82O-S02019-1ML |
黄曲霉毒素G1(AFG1) [1165-39-5] |
2 μg/mL溶于乙腈, 1 mL |
|
82O-S02020-1ML |
黄曲霉毒素G2(AFG2) [7241-98-7] |
0.5 μg/mL溶于乙腈,1 mL |
|
82O-S02030-1ML |
黄曲霉毒素M1(AFM1) [6795-23-9] |
0.5 μg/mL溶于乙腈,1 mL |
|
色谱柱及保护柱 |
||
|
86005 |
UHPLC/HPLC兼容色谱柱 Leapsil C18 |
100 × 2.1 mm, 2.7 μm |
|
HPLC溶剂缓冲盐离子对试剂 |
||
|
50101 |
乙腈 HPLC级 |
4 L |
|
50102 |
甲醇 HPLC级 |
4 L |
|
50144 |
甲酸 HPLC级 |
50 mL |
|
通用色谱产品 |
||
|
52401B |
瓶架/蓝色（现货） |
50孔 |
|
52401A |
瓶架/白色（现货） |
50孔 |
|
1034 |
样品瓶（棕色/螺纹） |
2 mL, 100/pk |
|
1035 |
样品瓶盖/含垫（已经组装） |
100/pk |
|
H80465 |
HPLC 进样针 |
25 μL |
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