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固相萃取常见问题与解答

1 固相萃取技术常见术语

目标化合物(Aimed Compounds):想要从复杂的样品基质中分离出来的化合物;

基质(Matrix):目标化合物所处的样品环境,基质中通常含有大量干扰物;

干扰物(Interferential Compounds):影响目标化合物分析或能够对分析仪器造成损害的化合物,通常是对基质中除目标化合物以外所有化合物的统称;

吸附剂(Sorbent):固相萃取柱中的填充物,能够从样品溶液中选择性地萃取某些化合物;

吸附容量(Capacity):在特定条件下,一定质量吸附剂能够保留的化合物(包括目标化合物和部分干扰物)的总质量;

选择性(Selectivity):吸附剂区别对待目标化合物和所有其它样品组分的能力,也就是保留目标化合物而排除其他组分的能力,高的选择性可以获得更佳的净化效果;

pH :溶液中质子(H+)浓度的负对数,该值越小表明溶液中质子的浓度越大;

pK a :酸性化合物解离常数(K a)的负对数,该值越小酸性化合物的解离性越强,当样品溶液的pH 值与pK a 相等时,未解离态化合物与解离态化合物浓度相等;分析人员也常用pK a 表示碱性化合物的解离性,但此时的pK a 值表示的是碱性化合物共轭酸的解离常数的负对数,该值越大表明碱性化合物结合质子的能力越强,碱性也越强;

相互作用(Interaction):在特定的化学环境中,两种化学物质之间(比如目标化合物与吸附剂之间、目标化合物与溶剂分子之间)发生的吸引或排斥等作用力;

非极性相互作用(Non-Polar Interaction):目标化合物上的非极性官能团与非极性吸附剂之间的作用力,这种作用力在极性溶剂环境尤其是水环境中才能较好体现,因而也称疏水相互作用,比如水环境中,邻苯二甲酸酯类化合物与C18 之间的作用力;

极性相互作用(Polar Interaction):目标化合物上的极性官能团与吸附剂上的极性官能团之间的作用力,这种作用力在弱极性或非极性溶剂环境下才能较好的体现;

离子相互作用(Ion Interaction):离子型目标化合物上的离子官能团与吸附剂上带有相反电荷的官能团之间的库伦力;

次级相互作用(Secondary Interaction):对于反相硅胶键合吸附剂,颗粒表面残余的硅羟基会与极性化合物发生极性相互作用,并且部分硅羟基解离后会与碱性化合物发生离子相互作用,相对于非极性相互作用这些作用力处于次要地位,因而被称为次级相互作用。次级相互作用是反相硅胶吸附剂所不期望的,通常可以通过封端技术(Endcaping)加以消除;

活化(Activation):也称溶剂化,加入合适的溶剂使吸附剂上的官能团展开,并除去吸附剂上可能存在的干扰物,对于反相吸附剂常常用中等极性溶剂(比如甲醇),正相吸附剂常常用弱极性或非极性溶剂(比如己烷);

平衡(Equilibrium):除去活化溶剂为上样创造适宜的溶剂环境,所用溶剂通常与样品溶液的溶剂一致;对于离子交换柱,如果样品是碱性化合物平衡液中往往需要加入酸,如果样品为酸性化合物平衡液中往往需要加入碱;

保留(Retention):当样品溶液通过吸附剂,吸附剂与某些化合物的作用力超过后者与溶剂的作用力时,这些化合物就会被吸附剂固定,该过程称为保留;

淋洗(Washing):上样后,部分干扰物与目标化合物同时被保留,需要加入合适的溶液以最大可能地除去干扰物而不影响目标化合物的保留,通常情况下用上样时的样品溶剂淋洗不会影响回收率,但洗脱强度较大的溶剂能最大程度地去除干扰物,选择淋洗液时需要在回收率和净化效果间找到平衡点;

洗脱(Elution):让洗脱能力较强的溶剂通过吸附剂,打断吸附剂与被保留的化合物之间的作用力,使这些化合物随溶剂从吸附剂中流出;通常情况下,能刚好洗脱目标化合物的洗脱溶剂是最佳选择,此时洗掉的干扰物最少,选择洗脱液时也需要在回收率和净化效果间找到平衡点;

穿透(Breakthrough):吸附剂的保留能力较弱或化合物的质量超过吸附剂容量时,在上样过程部分或全部目标化合物未被保留即流出小柱的现象;该现象属于操作事故,应避免发生。


2 亲水亲脂平衡

“亲水亲脂平衡”(Hydrophilic Lipophilic Balance,HLB),起初用以表示“表面活性剂分子中的亲水基团与亲油基团的平衡关系。”21世纪初,“亲水亲脂平衡”理念被引入SPE,其填料基质为聚合物(比如聚苯乙烯),基质具有亲脂性,与C18功能类似,具有反相保留功能;然后在聚合物基质上键合极性基团,比如吡咯烷酮,具有亲水性,该基团能够增强填料对极性化合物的保留能力,并使填料保持水可润湿性防止柱床干涸,提高了结果稳定性;

迪马科技推出的ProElut PLS兼具亲水基团(吡咯烷酮基团)和疏水基团(二乙烯基苯),对极性化合物和非极性化合物均有较好的保留,具有亲水亲脂平衡的特性。与之相同的小柱还有Waters Oasis HLB。

亲水亲脂平衡小柱一般具有以下特点:
A 真正的通用性:对亲水物质和亲脂物质具有均衡的保留能力,应用领域覆盖了非极性、弱极性极性化合物,克服了C18 吸附剂对极性化合物保留较差的缺点;
B 更高的稳定性:具有水可润湿性,填料经活化后,即使柱床干涸,吸附剂对目标物的保留也不会发生变化;
C 更宽的pH 值适用范围:PLS 的基质为有机聚合物而非硅胶,在pH 0-14 的范围内表现稳定,而硅胶键合吸附剂只有在2-7.5 的范围内是稳定的;
D 更高的吸附容量:可保留更多的目标物,有效地防止了“穿透现象” 的发生,提高了重现性;
E 不存在次级相互作用:硅胶键合吸附剂的表面存在未键合的硅羟基,对碱性化合物的保留较强,用硅胶键合吸附剂处理碱性化合物,回收率通常较低;PLS 是有机聚合物基质的吸附剂,不存在次级相互作用,用于碱性化合物能够得到满意的结果。

3 目标物没有回收或回收率低
在一次完整的SPE 操作中,目标化合物可能会存在于样品溶液流出液、淋洗液、洗脱液或吸附剂中,当“目标物没有回收或回收率低” 现象发生时,可向样品溶液加入标液,然后进行完整的SPE 操作并将样品流出液、淋洗液和洗脱液分别收集并分析,首先确定目标化合物存在于哪一部分,进而确定问题来自下列哪一环节:
A 目标物在吸附剂上的保留不足;
B 目标物未被完全洗脱;
C 其他环节

A  当超过5% 的目标化合物出现在样品流出液或淋洗液时即可断定“目标化合物在吸附剂上的保留不足”。下面是具体原因的改进办法:

B 当目标化合物在样品溶液流出液和淋洗液中未出现而洗脱液中仅有少量或未出现时,可判断“目标物未被完全洗脱”。
下面是具体原因的改进办法:

C 如果目标化合物在洗脱液中正常出现,那么回收率不足的问题应该来自样品前处理的其他环节。

4 回收率重现性差

可能原因 改进办法
上样前,柱床干涸 重新活化并平衡
吸附剂填装松散,溶液出现短路 提出换货,或用小棍挤压柱床
样品液流速过快 降低流速,通常来说流速低于5 mL/min 时,结果是稳定的

 5 净化效果不理想

A 净化模式的改进

通常而言采用保留目标化合物的模式比保留杂质的模式净化效果好,如果正在分析的项目为某一种或某一类化合物分析,最好是采用保留目标化合物的净化模式;举一个简单的例子,同样是分析蔬菜中的多菌灵和噻菌灵( 一类碱性农药),使用阳离子交换柱可以专一性地保留这些农药,使它们基本与干扰物完全分离,而使用正相吸附剂或石墨化碳黑进行保留干扰物的操作仅能把主要的干扰物除去,仍有较多干扰物存留。

另外,如果不止一种SPE 柱可用于目标化合物的净化时,应挑选选择性好的吸附剂;选择性方面,离子交换>正相>反相。

B 淋洗液和洗脱液的优化
对于反相模式和正相模式,应在不影响回收率的前提下,增大淋洗液洗脱的强度并降低洗脱液的洗脱强度。

对于反相模式,可将目标化合物的水溶液上样,然后依次用5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 的甲醇水溶液洗脱,分别收集洗脱液分析,建立淋洗曲线,找出目标化合物被洗脱时的溶剂体系,淋洗液中甲醇的含量应稍低于目标化合物恰好被洗脱时的溶剂体系,而洗脱液中甲醇的含量应稍高于目标化合物恰好被完全洗脱时的溶剂体系;当纯甲醇不能洗脱目标化合物时,应试验甲醇- 甲基叔丁基醚混合溶液的洗脱曲线;对于某些既不溶于水也不溶于甲醇的离子型化合物,可以在溶剂体系中加入酸或碱。

对于正相体系,可将目标化合物的正己烷溶液上样,然后依次用5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 的正己烷甲基叔丁基醚溶液洗脱,分别收集洗脱液分析,建立淋洗曲线,找出目标化合物被洗脱时的溶剂体系,淋洗液中甲基叔丁基醚的含量应稍低于目标化合物恰好被洗脱时的溶剂体系,而洗脱液中甲基叔丁基醚的含量应稍高于目标化合物恰好被完全洗脱时的溶剂体系。

C 对SPE 柱进行合理的处理

SPE 柱中的吸附剂可能存在少量干扰物,有效地活化可以避免这些干扰物进入洗脱液,活化溶液应选择整个操作中洗脱强度最强的溶剂体系;在反相模式中,从样品溶液到洗脱液主要涉及0%-100% 甲醇水溶液,所以活化溶液应选纯甲醇,当目标化合物需要用甲醇-甲基叔丁基醚混合液洗脱时,活化溶液应选甲基叔丁基醚;在反相模式中,从样品溶液到洗脱液主要涉及0%-100% 正己烷- 甲基叔丁基醚溶液,所以活化溶液应选纯甲基叔丁基醚。

6 流速过低

可能原因 改进办法
样品溶液含有较多颗粒杂质,堵塞了筛板 上样前对样品溶液进行离心或过滤
样品溶液黏度太高 用合适的溶剂对样品进行稀释
SPE 柱柱床太高,对液体的阻力过大 使用固相萃取仪,并在液体路出口减压
在液体入口加压